產(chǎn)品中心

castPCR Genotyping Master Mix

包裝規(guī)格：

儲運溫度：

-20℃長期保存，避免反復凍融，短期使用可放4℃。

產(chǎn)品說明：

castPCR Genotyping Master Mix是采用Taqman探針法競爭性等位基因特異性PCR技術（Competitive Allele-Specific Taqman PCR，castPCR）進行SNP分析以及檢測InDels (Insertions and Deletions，插入和缺失)的專用2 x 預混液，只需要額外加入預先設計好的Allele 1特異檢測引物，Allele 2特異檢測引物，Locus特異擴增引物，模板和滅菌蒸餾水即可進行SNP分析以及檢測InDels，使用方便，采用全自動核酸提取儀、PCR儀，3 種熒光的熒光定量PCR 儀或多通道熒光讀板機（酶標儀），靈活采用96孔板、384孔板，一天可檢測幾萬個SNP 位點。

精心研制的抗體修飾熱啟動Taq酶，Allele 1 FAM 熒光通用引物和Allele 2 HEX 熒光通用引物，配合反復優(yōu)化的Buffer，增強了在低濃度和復雜模板上的分型成功率，同時本產(chǎn)品提供ROX Reference Dye用于校正加樣孔之間的體積誤差和熒光信號誤差，不用Reference Dye校正的qPCR擴增儀器，使用時無需添加ROX。

實驗過程：

用Real-time PCR system型熒光定量PCR儀，采用基因分型-終點測定法對樣品進行檢測。96孔PCR 板及384 孔板最小反應體系分別為10μL和5μL。

1. 反應液的配置分裝，務必使用無污染的新吸頭，EP管，盡量避免污染。

2. 溶解所有用到的試劑，輕柔上下顛倒混勻，短暫瞬時離心將溶液甩至管底；

3.按下列組份配制qPCR混合液，將除模板以外的試劑混成mix，再分裝到單個PCR管內(nèi)，最后加入模板DNA。

注意：長期保存2 x castPCR Genotyping Master Mix置于-20℃，4℃保存可保存1周，凍融請勿超過 3 次。

4.短暫瞬時離心后放入熒光定量PCR儀中運行，qPCR反應程序如下：

5.其他循環(huán)條件:

   如果未獲得明確的基因分型簇，則應將平板熱循環(huán)額外3-10個循環(huán)，并再次讀取。

分型失敗問題分析：

若分型失敗，請嘗試以下幾種解決方案：

（1）DNA 濃度過低。保證每個反應體系內(nèi)有 10ng 以上模板DNA，大基因組物種如小麥，請保證 100ng 以上。

（2）DNA 含有大量 PCR 抑制劑，請將模板進行梯度稀釋再次嘗試，或者重新純化 DNA。

（3）DNA 濃度嚴重不均一，分型較差的樣本 DNA 含量過低。請重新準備 DNA 樣本。

（4）PCR 循環(huán)太少。

（5）實際上分型已經(jīng)成功，但群體中只有一種等位基因型，因缺乏其它等位基因的對照，導致分型誤判。

（6）引物自身擴增差。請更換擴增好的引物進行實驗。

（7）引物失效，請重新合成引物。

（8）試劑失效。請在有效期內(nèi)使用 。請將待使用的 試劑儲存在-20℃冰箱中，并減少凍融次數(shù)。

（9）使用不合格 PCR 板（管），請確認該耗材可以正常進行 PCR 擴增。在潔凈度差的場所生產(chǎn)的板子，或者某些帶有熒光增白劑的 PCR 板（尤其是部分白色板子），有非常嚴重的自熒光現(xiàn)象，導致信號異常。

（10）若只有雜合和一種親本等位基因型，缺少另一種親本等位基因型。A)請檢查群體是否為回交世代；B） 異源多倍體的位點多拷貝現(xiàn)象，請設計單一拷貝特異引物；C）該等位突變純合致死，無純合現(xiàn)象，或純合現(xiàn)象罕見。

（11）若出現(xiàn)單個嚴重離群點，請檢查：A）該 PCR 孔內(nèi)是否有顏色污染；B）該 PCR 孔是否漏加/破損泄露/ 蒸發(fā)。請刪除該數(shù)據(jù)點，并重新實驗。

背景知識：

等位基因特異擴增（Allele specific PCR, ASP）

在 PCR 技術發(fā)明幾年后的 1988年，等位基因特異擴增（ASP）/擴增受阻突變體系（Amplification refractory muta- tion system，ARMS）技術出現(xiàn)。該技術原理簡單，即利用引物3’最后1~4個尤其是最后1個堿基的差異，區(qū)分并特異擴增特定等位基因 DNA 片段。

天然 DNA 聚合酶對 3’最后幾個堿基的復性匹配/錯配選擇并不好，早期應用該技術須有額外的手段保證選擇性。如在引物末端人為引入新錯配，或者調(diào)整 PCR 退火溫度， 但這些手段相對復雜且有穩(wěn)定性問題，一直困擾著這個原理簡單的 SNP 分型技術，因而應用并不廣泛 。

KASP技術從根本上解決了 DNA 聚合酶及 PCR 體系對 SNP 識別的問題，能嚴格進行特異擴增，產(chǎn)生正確的等位基因擴增信號。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）

熒光基團和對應熒光淬滅基團距離較近時，熒光基團發(fā)出的熒光，會被淬滅基團吸收，發(fā)射出更長波長的熒光或者放出熱量。此時在此熒光對應的波長內(nèi)檢測不到該基團熒光信號。一旦二者分離， 則熒光信號可被檢測到。

采用了 FRET 原理來檢測 FAM 以及 HEX 熒光引物的擴增信號，對應的等位基因發(fā)生擴增時，將出現(xiàn)對應的熒光信號。