技術(shù)服務(wù)

技術(shù)原理：RACE (rapid-amplification of cDNA ends)，即cDNA末端快速克隆技術(shù)。RACE基于PCR技術(shù)基礎(chǔ)之上，先由RT-PCR從RNA中獲取cDNA片段，再通過設(shè)計引物與PCR向兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端或5'端序列，是一種從低豐度的轉(zhuǎn)錄本中快速擴(kuò)增cDNA的5'和3’末端的有效方法。相比于其他獲得新基因的方法，RACE原理簡單、無需建立文庫、快速廉價，正受到越來越多科研工作者的重視。

3'末端RACE：
利用mRNA的3'末端的poly（A）尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo（dT）30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)第一鏈cDNA。然后用一個基因特異引物作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3' 末端的DNA片段擴(kuò)增出來。


5'末端RACE：
利用一條基因特異性反轉(zhuǎn)錄引物，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈，將RNA-DNA雜合鏈中的RNA降解純化后，利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA鏈的3’端加入PolyC尾巴，然后利用錨定引物和一條基因特異性引物擴(kuò)增。

實驗步驟：
1. 總RNA的提?。何覀儗⑹褂肨RIzol法來提取實驗材料的總RNA，這一步可由您自己完成。
2. cDNA的合成與檢測：反轉(zhuǎn)錄生成cDNA的第一鏈，再生成cDNA第二鏈，電泳檢測cDNA的產(chǎn)量。
3. RACE 擴(kuò)增：我們使用錨定PCR（AnchoredPCR）與巢式PCR（Nested PCR）相結(jié)合的方法，用試劑盒分別進(jìn)行3'末端和5'末端RACE。
4. RACE產(chǎn)物檢測測序：將RACE產(chǎn)物TA克隆并進(jìn)行測序。

客戶需要提供：
實驗樣品：
提取Total RNA的材料：動植物組織，細(xì)胞或菌液（保證材料充足），液氮或干冰運輸；

或者由您直接提供總RNA： 3’RACE：Total RNA>15μg； 5’RACE：Total RNA>25μg。

序列信息：
大于200bp的已知序列(請注明已知序列的5’端及3’端)：如果已知序列比較短，建議先進(jìn)行3’RACE再進(jìn)行5’RACE，以提高實驗的成功率；
實驗數(shù)據(jù)和參考文獻(xiàn)：這將會幫助我們更好地理解您的實驗背景，有利于實驗的順利進(jìn)行。
 
實驗將得到的結(jié)果：
實驗報告：引物信息實驗過程 PCR產(chǎn)物照片；
測序結(jié)果：測序彩色波形圖、測序方向圖、堿基序列圖；
實驗產(chǎn)物：引物、測序用質(zhì)粒（限產(chǎn)生克隆測序的情況）。
 
服務(wù)說明：
1. 請保證材料或者總RNA新鮮，如果基因的含量較低或者未知序列較長，樣品量需相應(yīng)增加；
2. 我們會根據(jù)已知序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，如果得不到目的序列或為非目的基因的序列，我們將停止實驗并收取實驗成本費用；如果得到序列與您提供的序列有個別堿基不符，我們在征求您的意見后決定是否進(jìn)行RACE實驗；
3. 我們將設(shè)計跨內(nèi)含子引物PCR檢驗基因表達(dá)水平，如果經(jīng)驗證，樣品中基因表達(dá)含量低時，我們將與您溝通后，決定下一步實驗使用的方法；

4. 對于原核生物RNA我們僅進(jìn)行5'RACE。

實驗周期及收費標(biāo)準(zhǔn)：

服務(wù)項目	基礎(chǔ)費用（500bp以內(nèi))	超過部分	周期（工作日）
3'RACE技術(shù)服務(wù)	3800元	2元/bp	15-20工作日
5'RACE技術(shù)服務(wù)	4800元	5元/1bp	15-20工作日

上述收費標(biāo)準(zhǔn)是針對正?；颍瑢τ诨蚝康陀谡５臉悠?，我們會使用特殊的方法，具體情況請與技術(shù)人員溝通協(xié)商。
服務(wù)說明：
1、如果您的樣品為原核生物，我們無法保證序列為3'端或5'端全長。
2、由于mRNA存在個體和組織差異，PCR產(chǎn)物測序或許會有套峰存在，此種情況之下我們會提供2個克隆的測序結(jié)果，由客戶最終確認(rèn)其準(zhǔn)確性。