產(chǎn)品中心

小量全血基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)

Mini Blood DNA Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
獨(dú)特的結(jié)合液/蛋白酶K迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞內(nèi)核酸酶，然后基因組DNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜， 再通過(guò)一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制物去除液和漂洗液將細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)去除，最后低鹽的洗脫緩沖液將純凈基因組DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.產(chǎn)品特點(diǎn)：
1.不需要使用有毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉淀等步驟。
2.快速，簡(jiǎn)捷，單個(gè)樣品操作一般可在20分鐘內(nèi)完成。
3.多次柱漂洗確保高純度，典型的產(chǎn)量200μl全血可提取出3-12μg，OD260/OD280典型的比值達(dá)1.7～1.9，長(zhǎng)度可達(dá)30 kb -50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。
4.從十幾個(gè)配方中優(yōu)選出的紅細(xì)胞裂解液配方，裂解快速完全，客戶可根據(jù)需要選擇購(gòu)買。
5.典型的產(chǎn)量200μl全血可提取出3-12μg 基因組DNA。

三.適用范圍：
     適用于快速提取全血基因組DNA。

四.儲(chǔ)存條件：
1.結(jié)合液CB或者抑制物去除液IR低溫時(shí)可能出現(xiàn)析出和沉淀，可以在37℃水浴幾分鐘幫助重新溶解，恢復(fù)澄清透明后冷卻到室溫即可使用。
2.為避免降低活性，方便運(yùn)輸，提供蛋白酶K為凍干粉狀，收到后，可短暫離心后，加入1毫升滅菌水溶解。因?yàn)榉磸?fù)凍融可能會(huì)降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
3.避免試劑長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中發(fā)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應(yīng)及時(shí)蓋緊蓋子。

五.注意事項(xiàng)：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000 rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機(jī)。
2.不同樣品尤其疾病樣品中白細(xì)胞數(shù)量差異可能非常大，因此產(chǎn)量的個(gè)體差異也可能非常大。
3.需要自備異丙醇。
4.開(kāi)始實(shí)驗(yàn)前將需要的水浴先預(yù)熱到70℃?zhèn)溆谩?br /> 5.為了最佳效果，最好使用新鮮血液標(biāo)本或者4℃存放少于3天的標(biāo)本，不要使用反復(fù)凍融超過(guò)3次的標(biāo)本，否則會(huì)嚴(yán)重降低產(chǎn)量。
6.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗脫，但應(yīng)該確保批pH大于7.5， pH過(guò)低影響洗脫效率。用水洗脫DNA應(yīng)該保存在－20℃。DNA如果需要長(zhǎng)期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。

關(guān)于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長(zhǎng)期放置過(guò)程中會(huì)同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應(yīng)而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預(yù)處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團(tuán)，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強(qiáng)堿性溶液，若不小心碰到，請(qǐng)用大量自來(lái)水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過(guò)程中可能有沉淀生成，請(qǐng)加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個(gè)新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液預(yù)處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

六.操作步驟：（實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)先閱讀注意事項(xiàng)）
提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無(wú)水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!

1.取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
如果全血起始量小于200μl，則用緩沖液BB補(bǔ)足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間，則后續(xù)操作需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間，則需要先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解操作（見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)后附錄）。
如果處理血樣為禽類、鳥(niǎo)類、兩棲類或更低級(jí)生物的抗凝血液，其紅細(xì)胞為有核細(xì)胞，因此處理量5-20μl，可加緩沖液BB補(bǔ)足到200μl后進(jìn)行后續(xù)步驟。

2.加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結(jié)合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鐘。溶液應(yīng)變清亮（但顏色偏黑色）。
  可選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多，需要去除RNA，可以在加入200μl 結(jié)合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。

平衡液預(yù)處理吸附柱備用：
使用平衡液預(yù)處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見(jiàn)前文“關(guān)于平衡液的使用”

3.冷卻后加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。
上述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴(yán)重降低產(chǎn)量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可以渦旋振蕩15秒混勻。

4.將上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

5.加入500μl抑制物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒，棄廢液。 

6.加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇!），12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

7.加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒，棄掉廢液。

8.將吸附柱AC放回空收集管中，13,000 rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應(yīng)。

9.取出吸附柱AC，放入一個(gè)干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中預(yù)熱效果更好）， 室溫放置3-5分鐘，12,000 rpm 離心1分鐘。將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鐘，12,000 rpm離心1分鐘。
洗脫體積越大，洗脫效率越高，如果需要DNA濃度較高，可以適當(dāng)減少洗脫體積， 但是最小體積不應(yīng)少于50μl，體積過(guò)小降低DNA洗脫效率，減少DNA產(chǎn)量。

10.DNA可以存放在2-8℃，如果要長(zhǎng)時(shí)間存放，可以放置在－20℃。

附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細(xì)胞裂解操作）：
1.吸取900μl紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)1.5ml離心管或者3ml紅細(xì)胞裂解液到一個(gè)15ml離心管。（紅細(xì)胞裂解液可向本公司購(gòu)買）

2.將抗凝全血（使用前回復(fù)到室溫）顛倒混勻后，吸取300μl全血和1ml全血分別加到上述1.5ml和15ml離心管中，顛倒6-8次，并倒置輕彈管壁，確保充分混勻。

3.室溫放置10分鐘（期間應(yīng)該顛倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細(xì)胞）。

4.12,000 rpm離心20秒（對(duì)于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鐘（對(duì)于15ml離心管），倒棄紅色上清，并小心的盡可能多的吸棄上清（注意不要吸到管底的細(xì)胞團(tuán)），留下完整的管底白細(xì)胞團(tuán)和大約10μl的殘留上清。
離心后在管底應(yīng)該見(jiàn)到白色的白細(xì)胞團(tuán)，也可能有一些紅細(xì)胞殘片和白細(xì)胞團(tuán)在一起，但是如果看到的是大部分的紅色細(xì)胞團(tuán)，說(shuō)明紅細(xì)胞裂解很不充分，應(yīng)該再加入紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞團(tuán)后重復(fù)步驟3，4。

5.加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細(xì)胞團(tuán)，充分分散白細(xì)胞團(tuán)。
其中由于肝素抗凝血的白細(xì)胞沉淀團(tuán)很難打散重懸，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液標(biāo)本。

6.現(xiàn)在可以按照操作步驟提取全血基因組DNA了。