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酵母高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒(離心柱型)(不含/含Lytic Enzyme)

Yeast HighPure Plasmid Mini Extraction Kit(Column)

包裝規(guī)格：

一.產(chǎn)品介紹：
   本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結(jié)合lytic Enzyme特異消化酵母細胞壁，能在1小時內(nèi)從酵母培養(yǎng)液中分離出高純度質(zhì)粒DNA。酵母收集后，加入破壁酶去除細胞壁后，然后堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜在高鹽、低PH值狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其它細菌成分去除， 最后低鹽、高PH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。

二.儲存條件：
1.第一次使用時，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液YP1（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液YP1中RNase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙形⒘縍NA殘留，在溶液YP1中補加RNase A即可。
2.環(huán)境溫度低時溶液YP2中SDS可能會析出渾濁或者沉淀，可在37℃水浴加熱幾分鐘，即可恢復澄清，不要劇烈搖晃，以免形成過量的泡沫。
3.Lytic Enzyme為蝸牛酶甘油儲液，因此比較粘稠，請小心取用，－20℃保存。 蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉酶，蛋白酶等20多種酶。適合破碎溶解各種酵母的細胞壁。
4.避免試劑長時間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化，各溶液使用后應及時蓋緊蓋子。

三.注意事項：
1.所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達到13,000rpm的傳統(tǒng)臺式離心機，如Eppendorf 5415C 或者類似離心機。
2.溶液YP3和去蛋白液PE中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。若沾染皮膚、眼睛時，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。
3.通常酵母質(zhì)粒拷貝數(shù)都很低，一般通過電泳或者分光光度計都很難檢測到。提取的質(zhì)粒如果用于下游試驗時通常建議使用量為： 1-5μl用做PCR 模板;5-10μl 用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選擇商業(yè)化的高效率的感受態(tài)細胞。
4.用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山梨醇， 0.1M Na2EDTA，28 mMβ-巰基乙醇)。配制方法：在600 ml 去離子水里面溶解 182.2克山梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調(diào)節(jié)PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.2%β-巰基乙醇(商品化的β-巰基乙醇摩爾濃度一般為14M)。
5.菌體濃度檢測一般OD600值為1的時候,釀酒酵母細胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和分光度計不同即使同樣細胞數(shù)量OD值變化也很大，以上僅供參考。
6.洗脫液EB不含有螯合劑EDTA，不影響下游酶切、連接等反應。也可以使用水洗脫，但應該確保pH大于7.5， pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應該保存在－20℃。質(zhì)粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影響下游酶切反應，使用時可以適當稀釋。

關于平衡液的使用
1.介紹：核酸吸附硅膠膜柱子長期放置過程中會同空氣中的電荷/塵埃發(fā)生反應而影響其核酸的結(jié)合能力。硅膠柱經(jīng)平衡液預處理后可大大減少柱子中硅膠膜的憎水基團，提高核酸的結(jié)合能力。從而提高硅膠柱子回收效率或者產(chǎn)量。平衡液是強堿性溶液，若不小心碰到，請用大量自來水清洗。用完后需蓋緊瓶蓋，以免接觸空氣。室溫保存。在保存過程中可能有沉淀生成，請加熱至37℃使沉淀完全消失。
2.使用方法：取一個新的硅膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中廢液，將吸附柱子重新放回收集管。此時平衡液預處理柱子完畢。接后續(xù)的操作步驟。

四.操作步驟：（實驗前請先閱讀注意事項）
 提示：
  第一次使用前請先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水乙醇，充分混勻，加入后請及時在方框打鉤標記已加入乙醇，以免多次加入!
  將RNase A全部加入溶液YP1中，混勻，每次使用后置于2-8℃保存。
  吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巰基乙醇，回復到室溫備用。

1.取1.5-5毫升酵母培養(yǎng)物(不超過5X107 cells)，9,000rpm離心30秒，盡可能的吸棄上清，收集菌體。
收集超過1.5毫升菌液，可以離心棄上清后，在同一個1.5ml管內(nèi)加入更多的菌液，重復步驟1，直到收集到足夠的菌體。

2.加入300μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；再加入50μl Lytic Enzyme儲液，充分顛倒混勻，37℃溫育1-3小時消化細胞壁，中間可顛倒數(shù)次幫助消化。
如果破壁效果不好導致質(zhì)粒產(chǎn)量低，可以加大lytic Enzyme 用量來提高酶工作濃度，還可以延長消化時間或者提高溫度到45℃來提高效果，不適合Lytic Enzyme消化的酵母可選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反復凍融等。玻璃珠法：向菌體中加入250μl溶液YP1(請先檢查是否已加入RNase A)重懸沉淀，徹底懸浮菌體，加入0.1g直徑為0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，渦旋振蕩10分鐘，靜置幾分鐘讓玻璃珠沉淀，小心吸取上清到一個新管后接后續(xù)步驟4。

3.13,000rpm離心1分鐘，盡可能吸棄上清，加入250μl溶液YP1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。  
如果有未徹底混勻的菌塊，會影響裂解，導致提取量和純度偏低。

4.加250μl的溶液YP2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次使菌體充分裂解，室溫放置4分鐘。
溫和地混合，不要劇烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時間不應超過5分鐘！以免質(zhì)粒受到破壞。此時菌液應變得清亮粘稠，如果菌體少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要準確的5分鐘。

5.加350μl溶液YP3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次，充分混勻時會出現(xiàn)白色絮狀沉淀。13,000rpm離心10分鐘，小心取上清。
加入溶液YP3后應該立即混勻，以免產(chǎn)生SDS的局部沉淀。

平衡液預處理吸附柱：
使用平衡液預處理硅膠膜吸附柱為必做步驟，具體方法參見前文“關于平衡液的使用”
6.將上一步所得上清加入吸附柱EC中（吸附柱放入收集管中）， 12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液。

7.加入500μl去蛋白液PE（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30-60秒，棄廢液。

8.加入600μl漂洗液WB（請先檢查是否已加入無水乙醇!），12,000rpm 離心30-60秒，棄掉廢液。

9.加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30-60秒，棄掉廢液。

10.將吸附柱EC放回空收集管中，13,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。

11.取出吸附柱EC，放入一個干凈的離心管中，在吸附膜的中間部位加50-100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水浴中加熱效果更好），室溫放置2分鐘，13,000rpm 離心1分鐘。如果需要較多量質(zhì)粒，可將得到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鐘。

洗脫體積越大，洗脫效率越高。如果需要質(zhì)粒濃度較高，可以適當減少洗脫體積， 但是最小體積不應少于50μl，體積過小降低質(zhì)粒洗脫效率，減少質(zhì)粒產(chǎn)量。